1、蛋白上样量过大。可降低蛋白上样量。
2、一抗是多克隆抗体，或一抗、二抗浓度太高。可更换成单克隆抗体，或降低抗体浓度，缩短抗体孵育时间，优化一抗和二抗的使用浓度。
3、洗膜不充分。可增加洗膜次数和Buffer用量，延长洗膜时间，或在Wash Buffer中添加终浓度0.05%的Tween-20。
4、目的蛋白在体内存在多种修饰形式，如乙酰化，甲基化，磷酸化，糖基化等。可查阅文献，用合适的方法去除蛋白的修饰，或选择合适的抗体。
5、目的蛋白降解。重新准备蛋白样品，并加入足够的蛋白酶抑制剂。
6、发光液质量问题，可选用发光清晰的ECL发光液。
